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实验动画视频：流式细胞术的原理和应用

实验动画视频：流式细胞术（Flow Cytometry）的原理和应用

流式细胞术（Flow Cytometry）是一种能够快速分析大量单细胞或其他微粒特征的实验技术。细胞在流体系统中依次通过激光检测区域，仪器同时采集散射光和荧光信号，从而获得每个细胞的大小、内部复杂程度以及特定分子表达等信息。

通过使用带有荧光标记的抗体或其他荧光探针，流式细胞术可以同时检测多个细胞表面或胞内标志物，因此广泛应用于免疫表型分析、细胞亚群鉴定、细胞凋亡、细胞周期、细胞增殖、细胞因子检测和肿瘤免疫研究等领域。

本期实验动画视频将介绍流式细胞术的基本原理，并重点讲解 FSC、SSC、荧光检测、流式抗体、多色补偿和设门分析等关键概念，帮助科研人员理解 Flow Cytometry 实验从样本制备到数据分析的基本流程。

什么是流式细胞术？

流式细胞术是一种以单个细胞或微粒为分析单位的检测技术。在实验过程中，经过处理的细胞悬液进入流式细胞仪，在流体系统作用下依次通过激光照射区域。

当每个细胞通过激光时，会产生不同方向的散射光。如果细胞表面或内部还带有荧光染料、荧光蛋白或荧光抗体，则同时会产生相应的荧光信号。

仪器将这些光学信号转换成电子数据，因此研究人员可以从大量细胞中分析不同细胞群体，并根据特定标志物的表达水平进一步区分细胞亚群。

核心理解： 流式细胞术的特点之一是以单细胞为基本分析单位。因此，与只得到整个样本平均信号的检测方法相比，流式细胞术能够显示不同细胞群体之间的异质性。

流式细胞仪的基本原理是什么？

一台流式细胞仪通常包含多个相互配合的系统，其中核心可以理解为流体系统、光学系统和电子检测系统。

1. 流体系统

流体系统负责将样本中的细胞输送至激光检测区域，并使细胞尽可能依次通过检测点。这样仪器才能对单个细胞产生的光学信号进行连续采集。

2. 光学系统

光学系统通常包括激光器、透镜、滤光片和检测器等组件。激光照射细胞后，可以产生散射光；如果细胞携带荧光分子，激光还可以激发荧光分子产生特定波长的发射光。

3. 电子与数据系统

检测器接收到散射光和荧光信号后，会将光学信息转换为可以被仪器处理的电信号和数字数据。最终可通过直方图、散点图或其他图形形式进行分析。

什么是 FSC 和 SSC？

FSC（Forward Scatter，前向散射）和SSC（Side Scatter，侧向散射）是流式细胞术中非常基础的两个散射光参数。

FSC：前向散射

FSC 是沿激光前向方向检测到的散射光。在一定实验条件下，FSC 通常与细胞大小具有一定关系，因此可以帮助研究人员粗略区分不同大小的细胞或颗粒。

SSC：侧向散射

SSC 是从激光侧向方向采集的散射光，通常与细胞内部颗粒度和结构复杂程度有关。

例如，具有较复杂内部结构或较多胞内颗粒的细胞通常可能表现出更高的 SSC 信号。

将 FSC 和 SSC 组合成散点图，可以对样本中的主要细胞群体进行初步区分，并作为后续设门分析的起点。

注意： FSC 和 SSC 可以为细胞大小和内部复杂程度提供重要参考，但二者并不是细胞类型的绝对判定指标。准确鉴定细胞亚群通常还需要结合特异性表面或胞内标志物。

流式细胞术如何检测荧光？

除散射光之外，荧光信号是流式细胞术最重要的信息来源之一。

在抗体流式实验中，研究人员通常使用带有荧光基团的抗体识别细胞表面或胞内的特定抗原。当带有荧光标记的细胞通过激光时，荧光分子吸收特定波长的激发光，并释放更长波长的发射光。

流式细胞仪通过相应的滤光片和检测器区分不同波段的荧光，从而判断细胞是否表达某个目标分子以及其相对荧光强度。

常见流式荧光标记包括 FITC、PE、APC 以及多种串联染料和其他荧光染料。具体应该选择哪一种，需要根据流式细胞仪的激光和滤光片配置进行设计。

什么是流式抗体？

流式抗体通常指经过 Flow Cytometry 应用验证、可用于识别细胞表面或胞内目标抗原的抗体。

根据实验设计，可以使用未偶联的一抗配合荧光二抗进行间接检测，也可以直接使用已经偶联 FITC、PE、APC 等荧光染料的直标抗体。

直接荧光抗体

目标抗体本身已经与荧光染料偶联，因此抗体与细胞抗原结合后即可直接进行流式检测。该方法步骤相对简单，也比较适合多色流式实验。

间接荧光检测

首先使用未标记的一抗识别目标抗原，再使用带有荧光染料的二抗识别一抗。间接法在某些实验中可以增强信号，但进行多色实验时需要更加注意二抗特异性和交叉反应。

如何选择合适的流式抗体？

流式实验对抗体选择有明确要求。即使某个抗体能够在 Western blot 中识别目标蛋白，也不代表它一定适用于 Flow Cytometry。

选择流式抗体时可以重点确认以下信息：

Flow Cytometry 应用验证： 优先选择明确经过 FC 或 Flow Cytometry 验证的抗体。
目标物种： 确认抗体能够识别 Human、Mouse、Rat 或实际实验使用的目标物种。
抗原位置： 如果进行活细胞表面染色，需要确认抗体识别的表位位于细胞膜外侧并且在天然状态下可被抗体接近。
荧光染料： 选择与仪器激光器及检测通道兼容的荧光偶联抗体。
抗原表达量： 对低表达抗原通常需要优先考虑较亮的荧光染料，而高表达抗原可以使用相对较弱的荧光标记。
固定和通透： 对胞内蛋白进行染色时，需要确认抗体是否适用于相应的固定和通透条件。
多色组合： 多色流式还需要考虑不同荧光染料之间的光谱重叠以及各抗原的表达水平。

什么是流式细胞术中的 Gating？

Gating（设门）是流式数据分析中的核心步骤之一。研究人员根据散射光或荧光参数，在图形中选定特定细胞区域，再进一步分析该区域内的细胞。

一个典型的流式分析过程可能需要经过多个连续的门，例如：

根据 FSC 和 SSC 选择主要细胞群： 初步排除明显的碎片和非目标事件。
选择单细胞群体： 使用 FSC-A、FSC-H 或其他相关参数排除细胞聚集体和双联体。
排除死细胞： 如果实验使用活死染料，可以进一步选择活细胞群体。
选择目标细胞亚群： 根据 CD45、CD3、CD4、CD8 或其他特异性标志物逐步鉴定所需细胞群体。
分析目标标志物： 在最终细胞群体中比较阳性比例、荧光强度或其他参数。

分析提示： Gating 不只是“在图上画一个框”。设门策略应该结合实验目的、细胞生物学信息以及阴性、单染、FMO 等对照共同确定。

什么是流式细胞术中的补偿？

在多色流式细胞术中，不同荧光染料的发射光谱往往存在一定程度的重叠。

例如，一个荧光染料的主要信号虽然应该由某个检测通道采集，但其部分发射光也可能进入其他通道。这种现象通常称为光谱溢出（Spectral Spillover）。

在传统多色流式分析中，需要利用荧光补偿（Compensation）对不同检测通道之间的光谱溢出进行数学校正，从而尽可能准确地区分不同荧光染料产生的信号。

补偿通常需要为实验中的每一种荧光染料设置适当的单染对照，可以使用细胞或适合的补偿微球完成。

实验提示： 多色流式中，补偿并不能弥补不合理的荧光组合。如果两个荧光染料光谱重叠严重，同时两个目标又存在明显共表达，仍可能降低细胞群体的分辨能力，因此 Panel 设计本身非常重要。

流式实验常用哪些对照？

合理的实验对照能够帮助区分真实信号、细胞自发荧光和非特异性染色，也是多色流式实验设计中的重要环节。

未染对照（Unstained Control）

不加入荧光抗体或荧光探针，用于了解细胞自身的散射和自发荧光水平，并辅助建立基础仪器参数。

单染对照（Single-Stain Control）

每个对照样本只含一种荧光染料，主要用于建立多色流式实验的补偿参数。

FMO 对照

FMO（Fluorescence Minus One）对照包含多色 Panel 中除目标检测通道对应荧光染料之外的其他荧光染料。

FMO 对照对于判断阴性与弱阳性群体之间的界限特别有帮助，尤其适用于复杂多色实验。

活死染色对照

死细胞往往更容易产生非特异性染色和异常荧光，因此很多流式实验会加入活死染料，以便在分析时排除死细胞。

生物学阳性和阴性对照

如果已知某类细胞表达或不表达目标抗原，可以利用相应样本帮助确认抗体染色和设门结果是否符合预期。

流式细胞术的基本实验步骤

不同实验的详细流程会有所不同，但典型抗体流式实验通常包含以下几个阶段：

制备单细胞悬液： 将血液、培养细胞或组织样本处理成适合流式分析的单细胞悬液。
细胞计数和质量检查： 确认细胞浓度及状态，并尽量减少细胞团块和碎片。
进行阻断： 根据实验需要进行 Fc receptor blocking 或其他非特异性结合阻断。
加入流式抗体： 根据经过优化的抗体浓度加入相应荧光偶联抗体。
孵育： 按照抗体和实验方案规定的时间、温度和避光条件进行染色。
清洗细胞： 去除未结合抗体，降低游离荧光物质产生的背景。
固定或通透： 如果检测胞内抗原，需要根据实验目标选择合适的固定和通透方法。
流式上机： 设置合适的 FSC、SSC 和荧光检测参数，并采集足够数量的细胞事件。
补偿和数据分析： 根据单染对照进行荧光补偿，再按照预先设计的 Gating Strategy 分析细胞群体。

流式细胞术有哪些常见应用？

1. 免疫表型分析

免疫细胞表面具有不同的 CD 分子及其他标志物。通过多种荧光抗体组合，可以同时检测多个细胞标志物，并区分不同类型的免疫细胞。

例如，在研究 T 细胞时，可以根据实验目的组合 CD3、CD4、CD8 以及其他相关标志物，对不同 T 细胞亚群进行分析。

2. 细胞表面蛋白检测

对位于细胞膜表面的受体、黏附分子和免疫检查点蛋白等，可以直接使用识别天然胞外表位的流式抗体进行染色。

3. 胞内蛋白检测

经过适当固定和通透后，流式细胞术还可以检测细胞内部的蛋白质，例如某些转录因子、细胞因子和磷酸化信号蛋白。

4. 细胞凋亡分析

流式细胞术可以结合 Annexin V、膜完整性染料或其他探针分析不同阶段的细胞死亡状态。

5. 细胞周期分析

利用能够与 DNA 结合的荧光染料测量细胞 DNA 含量，可以分析细胞群体在 G0/G1、S 和 G2/M 等不同细胞周期阶段的分布。

6. 细胞增殖研究

某些荧光示踪染料可以随着细胞分裂逐渐稀释，因此能够用于研究细胞分裂次数和增殖情况。

7. 细胞因子检测

通过胞内细胞因子染色，可以分析特定细胞群体产生 IFN-γ、IL-2、TNF-α 等细胞因子的情况，并同时结合细胞表面标志物确定产生细胞因子的细胞类型。

8. 肿瘤和免疫研究

流式细胞术广泛用于肿瘤微环境、免疫细胞浸润、免疫检查点、肿瘤细胞表型及免疫治疗相关研究。

什么是多色流式细胞术？

多色流式细胞术（Multicolor Flow Cytometry）是指在同一个样本中使用多种不同荧光标记，同时检测多个生物标志物。

多色检测可以在有限样本中获得更多单细胞信息，但随着检测颜色数量增加，实验设计复杂度也会明显提高。

设计多色 Flow Cytometry Panel 时通常需要考虑：

仪器具有哪些激光器；
每个荧光检测通道使用什么滤光片；
不同荧光染料之间的光谱重叠；
每种抗原在细胞上的表达水平；
哪些标志物可能在同一细胞上共表达；
荧光染料的相对亮度；
是否需要固定和通透；
是否具有合适的单染及 FMO 对照。

流式细胞分析和细胞分选有什么区别？

普通流式细胞分析主要用于检测和分析不同细胞群体。当细胞通过仪器后，研究人员获得其散射和荧光数据。

而具有细胞分选功能的流式仪器，还可以根据预先设定的荧光和散射特征，将特定目标细胞群体从混合样本中物理分离出来。

分选得到的细胞可以根据实验设计进一步用于培养、分子分析或其他下游研究。

为什么流式实验背景高？

流式实验出现背景过高或阴阳性群体分离不清时，可能与多个因素有关。

抗体浓度过高： 过量抗体容易增加非特异性结合，因此建议通过抗体滴定确定合适用量。
死细胞较多： 死细胞容易产生异常或非特异性染色，应尽量改善样本质量并考虑加入活死染料。
Fc 受体结合： 某些免疫细胞表面的 Fc receptor 可能导致抗体非特异性结合，可根据实验需要使用 Fc blocking。
清洗不足： 未结合的游离荧光抗体残留可能增加背景。
补偿不合适： 多色流式中的光谱溢出如果没有得到正确校正，可能使其他通道出现异常信号。
细胞自发荧光： 不同细胞类型的自发荧光水平不同，因此需要结合未染对照进行判断。

为什么流式实验没有明显阳性信号？

如果目标细胞没有出现预期的阳性荧光，可以从多个方面排查：

确认目标细胞是否实际表达目标抗原；
检查抗体是否经过 Flow Cytometry 应用验证；
确认抗体反应物种是否正确；
检查荧光染料是否与仪器激光和检测通道匹配；
对胞内抗原检查固定和通透条件是否合适；
检查抗体使用浓度和孵育时间；
确认仪器参数和 Gating Strategy 是否合理；
使用已知阳性样本判断抗体和染色体系是否能够正常工作。

流式细胞术常见问题

Flow Cytometry 和流式细胞术是一个意思吗？

是。Flow Cytometry 通常翻译为流式细胞术，是一种利用流体、激光和光学检测系统逐个分析细胞或颗粒特征的技术。

FSC 和 SSC 分别代表什么？

FSC 是 Forward Scatter，即前向散射，通常可用于反映细胞大小相关特征；SSC 是 Side Scatter，即侧向散射，通常与细胞内部颗粒度和结构复杂程度有关。

做流式一定要使用荧光抗体吗？

不一定。FSC 和 SSC 本身不需要荧光抗体即可获得散射光信息，但如果需要检测特定细胞表面或胞内抗原，通常需要使用相应的荧光抗体或其他特异性荧光探针。

Western blot 抗体可以直接用于流式吗？

不能简单这样判断。Western blot 中的蛋白通常经过变性，而流式细胞术尤其是细胞表面染色需要抗体识别天然构象下的抗原。选择流式抗体时应优先查看是否具有 Flow Cytometry 应用验证。

什么是 Flow Cytometry Compensation？

Compensation 即荧光补偿，用于校正传统多色流式实验中一个荧光染料的发射信号进入其他检测通道所造成的光谱溢出。

为什么多色流式需要单染对照？

单染对照可以显示每种荧光染料在不同检测通道中的信号分布，因此可以帮助计算和设置多色流式实验所需的荧光补偿。

FMO 对照有什么作用？

FMO 对照在完整多色 Panel 的基础上去掉一个目标荧光标记，可以帮助研究人员了解其他荧光信号对该通道产生的影响，因此特别适合辅助确定弱阳性群体的设门位置。

流式细胞术可以检测胞内蛋白吗？

可以。通常需要先进行适当固定和通透，使抗体能够进入细胞并识别胞内目标蛋白。不同抗原对固定和通透方法的耐受性可能不同，因此需要根据目标抗体优化实验条件。

流式抗体为什么需要滴定？

抗体使用过少可能造成阳性信号不足，使用过多则可能增加背景和非特异性染色。通过抗体滴定可以寻找在信号分辨率和试剂用量之间更合适的实验浓度。

总结

流式细胞术（Flow Cytometry）是一种以单细胞为基本分析单位的高通量检测技术。细胞依次通过激光检测区域后，仪器采集 FSC、SSC 和荧光信号，从而分析细胞的物理特征和特定生物标志物表达。

使用荧光偶联抗体后，可以进一步进行免疫表型、细胞亚群、胞内蛋白、细胞凋亡、细胞周期、细胞增殖和细胞因子等多种研究。

对于多色流式实验，除了选择适合的 Flow Cytometry 抗体，还需要重点考虑荧光染料组合、仪器激光配置、抗体滴定、单染对照、荧光补偿、FMO 对照以及 Gating Strategy，才能获得更加可靠和易于解释的数据。