【Biorbyt 技术】如何选择合适的流式抗体？

 

什么是流式细胞术？

流式细胞术（Flow Cytometry，FC）是一种基于荧光的，在液流系统中快速测定单个细胞或细胞器的生物学性质，例如细胞群计数和蛋白丰度等。流式细胞术结合细胞分选仪还可以进一步把特定的细胞或细胞器从群体中加以分类收集的技术,该过程称为荧光激活细胞分选法 (FACS)。流式细胞技术在细胞生物学、细胞凋亡研究和免疫学方面起着非常重要的作用。

 

流式细胞仪如何工作？

在流式细胞术中使用的仪器称为流式细胞分析仪，通常缩写为“细胞分析仪”。流式细胞分析仪由一个用于进行细胞处理的流体系统和一个包括数据采集信号检测器和处理器的光学系统组成。

关于流式细胞仪更详细的工作原理，点击以下了解。

视频

 

流式细胞实验中如何选择合适的抗体？

在流式细胞实验过程中，荧光抗体对单细胞悬液的标记效果直接影响着实验的数据质量。

随着流式细胞术的日益发展，流式抗体及荧光标记产品的种类、数量也在不断增多，加上多色分析实验方案需求的增长，逐渐产生了抗体难选择、荧光难搭配等问题，如何选择合适的流式抗体，也成为了流式技术是否能成功的关键因素之一。  
 

Biorbyt 在本篇文章中就来聊聊流式抗体选择的小技巧。

 

1）确定抗体基本信息

• 确定所需检测的指标，目的细胞的特异性表面标记或胞内标记；

• 根据检测样本的种属选择可适用的抗体；

• 根据抗体的说明，明确是否可以用于流式实验。

2）确定所使用仪器的参数配置

• 激光器：不同的流式细胞仪激光器不同，常见的有405nm，488nm和635nm，需要根据具体的仪器进行确定。

• 滤光片：检测通道的多少，决定最多可以同时检测几个指标。荧光素的发射波长与滤光片有关，所选择荧光素要在仪器的可检测范围内。

• 仪器：相同的荧光在不同的仪器上检测通道可能不同，需要参照仪器的说明。

3）荧光素的选择

• 抗原表达弱或分群不明显的建议选择强荧光，如PE、APC。

• 抗原表达强或分群明显的建议选择最常用的弱荧光例如FITC。

• 常用荧光强弱排序程度为：PE>APC>PE-cy5Cy5>PercCPp-Cycy5.5>FITC

4）多色荧光搭配

• 同时检测几个指标时，就需要多个荧光标记进行搭配。流式抗体荧光标记搭配主要由3个因素决定的：流式细胞仪能检测多少个通道、需要同时检测检测多少个指标、厂家的抗体有多少种荧光标记。

• 注意所使用的仪器有哪些激光，每个激光检测通道只能选择1种荧光素，各通道之间的荧光素可以随意搭配，检测通道不能冲突。

• 如果需要做多个指标，而流式细胞仪能检测的通道不够，科研将指标归成2类，再将样本分成2份，分别进行检测。

• 所选各种荧光素光谱的重叠应当尽量减少，否则将会导致较大的补偿。例如，PE-Cy5与APC同时标记，将会导致补偿过度，需换成PE-Cy5.5或PerCP-Cy5.5。

5）同型对照抗体的选择

• 同型对照，是用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色，类似于阴性对照，是流式细胞实验不可或缺的一项。

• 同型对照是使用与一抗相同种属来源、相同亚型及亚链、相同荧光标记的免疫球蛋白，也要求使用相同剂量。如一抗是抗human CD3-FITC(mouse IgG1)，同型对照则为Mouse IgG1-FITC.

• 如果是纯化的一抗加荧光标记的二抗，那么应该选择与一抗相对应的同型对照抗体，如纯化的CD3+PE标记的二抗，则对照为纯化的同型对照+ PE标记的二抗。

• 有时候同型对照的表达会比抗体的表达高，首先检查同型对照的抗体是否加错类型、剂量等。其次，因为有些标志在细胞的表面或者胞内表达不高，而跟其类似的抗原非常多，那么同型对照非特异性的结合会超过抗体的特异性，所以会造成这种现象。这个时候推荐使用其他阴性对照，如空白对照等。

6）直接法与间接法染色的选择

• 直接法：即使用直接偶联抗体，可直接多重分析来自同一宿主的抗体。由于孵育和洗涤步骤更少，因此实验步骤更快，并且能够在一项检测中使用许多不同的抗体，从而能够同时读取大量终点。

• 间接法：即使用非偶联一抗 + 偶联二抗，可改善以低丰度存在的靶标的检测，同时由于二次放大可提供更高的灵敏度（多个二抗结合一个一抗）。当直接偶联物尚未获得时，有助于一抗的初始验证。

 

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