免疫印迹试验 (Western Blot)

---

蛋白免疫印迹即Western Blot基本原理是通过对凝胶电泳分离的细胞或生物组织样品的抗原与抗体特异性反应进行着色，通过分析着色条带的位置和着色深度获得目的蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况。 

Western blot的主要过程是经由PAGE (聚丙烯酰胺凝胶电泳) 分离的蛋白质样品，转移到固相载体 (NC膜，PVDF膜) 上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的蛋白的大小和表达量。 
 

一．实验材料 
新鲜组织或细胞样本 
 

二．实验试剂,实验试剂配方 
1. SDS-PAGE试剂 
2. 匀浆缓冲液 
3. 电泳缓冲液 
4. 转膜缓冲液 
5. 胶染色液 
6. 显色液 
 

三．实验操作步骤 
(一) 组织或细胞裂解液样品制备     
1. 单层贴壁细胞总蛋白的提取 
2. 组织中总蛋白的提取 
3. 加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取

(二) 样品蛋白定量     
1. SDS-PAGE 法 
2. Bradford法 
3. BCA法

(三) SDS-PAGE电泳     
1. 清洗玻璃板 
2. 灌胶与上样

   (1) 根据不同分子量的蛋白选择不同浓度的分离胶：

蛋白分子量 (kDa)	凝胶浓度 (%)
4-40	20
12-45	15
10-70	12
30-100	10
50-200	8

   (2) 配4%浓缩胶，灌胶。待到浓缩胶凝固后，两边竖直向上，保持梳子水平将其拔出。 
   (3) 煮样。上样前要将样品 (加loading buffer) 于金属浴98℃中煮5min使蛋白变性。 
   (4) 选择相应蛋白大小的预染蛋白Marker，以助于分辨蛋白的大小和电泳示踪。 
   (5) 加足够的电泳液后上样,每孔上样量为20-40μg蛋白，点样时注意样品不要溢入相邻上样孔，避免戳到胶孔，避免样品孔交叉污染。

3.电泳    
应根据电泳仪说明书推荐方法进行电泳，电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。 

 

(四) 转膜     
1.根据胶的尺寸准备相同大小的滤纸6张和膜1张 (一定要戴手套) 。PVDF膜须置于甲醇中1~2 min，去离子水清洗几次，并用转移液平衡后待用。NC膜可用转膜缓冲液润湿后直接使用。 
2.在加有转膜液的托盘里放入转膜用的夹子、海绵垫、玻棒或塑料板、滤纸和浸过的膜。 
3.将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，排除里面的气泡。在垫子上垫三层滤纸，排除气泡。 
4.分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，除去气泡。将膜盖于胶上，在膜上盖3张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，除气泡后合起夹子。 
5.将夹子放入转移槽槽中，夹的黑面对槽的黑面，白面对槽的红面。根据蛋白分子量决定转膜条件。  
6.检查转膜情况。转完后将膜用1×丽春红染液染约2~5min。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。

(五) 免疫反应     
1.膜的封闭，为防止一抗及 (或) 二抗于膜产生非特异性结合，转膜后需要对膜进行封闭。一般采用5%脱脂奶粉，或3%BSA。封闭时，4 ℃摇床上摇动封闭过夜，或37 ℃封闭2小时。封闭结束后可用TBS洗膜5-10秒，进行抗体孵育。 
2.孵育一抗/二抗 
(1) 根据抗体说明书建议的稀释倍数，用TBST (或加1%~3%脱脂奶粉) 稀释一抗。 
(2) 将膜装入自封袋并用压膜机固定，抗体溶液加入到自封袋中，确保抗体的体积足够孵育膜；37 ℃摇晃孵育1 ~ 3 h (具体时间根据抗体效价和浓度而定) ，或者4 ℃孵育过夜，用TBST在室温下摇床上洗3~4次，每次5 ~ 10 min。  
(3) 同上方法准备二抗稀释液并与膜接触洗涤后，进行化学发光反应。其中二抗根据说明书建议的稀释倍数稀释，室温摇晃孵育1 ~2h。

(六) 化学发光、显影、定影     
1.在暗室中，将显影液和定影液分别到入塑料盘中；将A和B两种试剂在离心管里等体积混合；将膜蛋白面与此混合液充分接触；1~2 min后，将膜去尽残液。  
2.在红灯下取出胶片，用切纸刀剪裁适当大小；打开胶片夹，把胶片放在膜上，关上胶片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间；曝光完成后，取出胶片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影结束后，立刻把胶片浸入定影液中，以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干、拍照，或者直接使用专门的化学发光成像仪进行膜显色观察和结果扫描拍照。