实验动画视频：高亮度红色荧光蛋白——tdTomato

tdTomato 是生命科学研究中常用的高亮度红色荧光蛋白（Red Fluorescent Protein，RFP）之一。它具有较强的荧光信号和良好的成像性能，因此被广泛应用于荧光成像、报告基因、细胞示踪、蛋白定位和转基因动物研究等实验场景。

tdTomato 为什么具有如此明亮的红色荧光？它与常见的 GFP、mCherry 有什么区别？tdTomato 的激发波长和发射波长是多少？在细胞和组织成像实验中又应该注意哪些问题？本期实验动画视频将带您了解 tdTomato 荧光蛋白的基本原理、特点及常见应用。

什么是 tdTomato 荧光蛋白？

tdTomato 是一种红色荧光蛋白，来源于对 DsRed 系列荧光蛋白的工程化改造。它属于串联二聚体（Tandem Dimer）荧光蛋白，名称中的“td”即来自 Tandem Dimer。

tdTomato 的设计将两个经过改造的 dTomato 单元连接在一起。这样的结构使其具有很高的整体荧光亮度，因此在需要较强红色荧光信号的细胞和组织成像实验中得到了广泛应用。

与传统的绿色荧光蛋白 GFP 相比，tdTomato 的荧光位于更长波长的红色区域，因此也常被用来与绿色或其他颜色的荧光蛋白组合，实现多通道荧光成像。

tdTomato 的激发和发射波长是多少？

tdTomato 的经典光谱参数中，激发峰（Excitation Maximum）约为 554 nm，发射峰（Emission Maximum）约为 581 nm。因此，在合适的荧光显微镜滤光片或激光系统下，可以观察到明显的橙红色至红色荧光信号。

tdTomato 常用光谱参数：
激发峰（Ex）：约 554 nm
发射峰（Em）：约 581 nm
荧光颜色：橙红色 / 红色区域
蛋白形式：Tandem Dimer（串联二聚体）

实际实验中，并不一定要求激发光源与峰值波长完全一致。是否能够有效检测 tdTomato，还取决于显微镜光源、激光波长、滤光片组合、探测器灵敏度以及样本本身的表达水平。

为什么 tdTomato 的荧光很亮？

荧光蛋白的“亮度”通常与多个光物理参数有关，其中包括消光系数（Extinction Coefficient）和荧光量子产率（Quantum Yield）。

简单来说，消光系数反映荧光分子吸收激发光的能力，而量子产率则与吸收光能后产生荧光的效率有关。两者共同影响荧光蛋白的分子亮度。

tdTomato 由两个荧光蛋白单元串联形成，因此具有较高的整体消光能力和强烈的荧光信号。这也是 tdTomato 长期以来受到细胞成像和动物模型研究关注的重要原因之一。

需要注意： 荧光蛋白的理论分子亮度并不等同于实际实验图像中的最终亮度。蛋白表达量、成熟效率、细胞环境、激发光源、滤光片、探测器以及成像参数都会影响最终观察到的信号。

tdTomato 有哪些特点？

tdTomato 之所以成为常用的红色荧光报告蛋白，与其多项实验特性有关。

• 荧光亮度高： tdTomato 能够产生较强的红色荧光信号，有利于识别表达水平较低或组织背景较复杂的样本。
• 红色发射光谱： tdTomato 的发射位于红色光谱区域，可以与 GFP 等绿色荧光蛋白进行多颜色组合实验。
• 适用于活细胞成像： 作为基因编码荧光蛋白，tdTomato 可以在活细胞中表达，从而观察细胞或目标蛋白的动态变化。
• 适合报告基因研究： 将 tdTomato 表达置于特定启动子或遗传调控系统控制下，可以利用红色荧光判断特定基因表达或重组事件。
• 容易进行组织观察： 强烈的红色荧光使 tdTomato 在组织切片、细胞示踪以及动物模型研究中具有较高的可视性。

tdTomato 和 GFP 有什么区别？

GFP（Green Fluorescent Protein，绿色荧光蛋白）是应用最广泛的荧光蛋白之一，而 tdTomato 则属于红色光谱范围的荧光蛋白。两者最直观的差别是激发和发射波长不同。

GFP：绿色荧光

GFP 及其衍生蛋白主要产生绿色荧光，具有成熟的实验体系和广泛的载体、抗体及成像设备支持，因此经常用于基因表达、蛋白定位和细胞示踪研究。

tdTomato：红色荧光

tdTomato 的发射光谱向红色区域移动，并具有较强的荧光信号。当实验需要同时观察两个不同细胞群体或多个目标时，可以根据光谱兼容性将绿色和红色荧光蛋白组合使用。

在多色荧光实验中，还需要合理选择激发光源和检测通道，并考虑不同荧光蛋白之间的光谱重叠，避免信号串色影响结果判断。

tdTomato 和 mCherry 有什么区别？

tdTomato 和 mCherry 都是常用的红色荧光蛋白，而且都来源于 DsRed 系列荧光蛋白的工程化改造，但二者在结构、光谱和实验特点方面存在差异。

tdTomato

tdTomato 是串联二聚体荧光蛋白，由两个荧光蛋白单元连接形成，整体荧光亮度较高。但由于其分子尺寸相对较大，在作为融合标签时需要考虑是否可能影响目标蛋白的正常功能或定位。

mCherry

mCherry 是单体红色荧光蛋白。与 tdTomato 相比，其单体结构在许多融合蛋白实验中更加方便，因此经常作为蛋白定位和融合表达标签使用。

因此，并不存在所有实验都应该优先选择 tdTomato 或 mCherry 的情况。如果实验更看重强信号，tdTomato 可能具有优势；如果标签大小或单体性质更加重要，则需要结合目标蛋白和具体实验目的进行选择。

tdTomato 为什么叫“Tomato”？

tdTomato 属于一系列经过工程化改造的红色及橙色荧光蛋白之一。研究人员曾根据这些荧光蛋白表现出的不同颜色，为多个变体采用与水果颜色相关的名称，例如 mOrange、mStrawberry 和 mCherry 等。

Tomato 对应其鲜明的橙红色荧光，而 tdTomato 中的“td”则表示 tandem dimer，即串联二聚体。因此，tdTomato 这个名称同时反映了其颜色特点和分子结构。

tdTomato 常用于哪些实验？

tdTomato 是一种基因编码的荧光报告蛋白，可以通过质粒、病毒载体或转基因系统在细胞和动物中表达，因此具有较广泛的实验用途。

1. 报告基因实验

研究人员可以将 tdTomato 编码序列置于特定启动子或调控元件控制下。当相应基因表达系统被激活时，细胞产生 tdTomato，从而通过红色荧光反映相应的基因表达活动。

2. 细胞示踪

tdTomato 的高可见度使其适合用于标记特定细胞群体。通过观察红色荧光，可以追踪细胞的位置、迁移以及在实验过程中的分布变化。

3. 细胞谱系追踪

在发育生物学和细胞命运研究中，可以将 tdTomato 与特定遗传系统结合，对特定来源的细胞及其后代进行标记，从而研究细胞分化和谱系关系。

4. 活细胞荧光成像

tdTomato 可以在活细胞中产生荧光，因此可用于实时观察细胞位置、表达变化或其他动态过程。根据实验设计，还可以与其他颜色的荧光蛋白组合进行多通道成像。

5. 蛋白定位研究

在适当的实验条件下，可以将 tdTomato 与目标蛋白构建为融合蛋白，通过红色荧光观察目标蛋白的亚细胞定位。

不过，由于 tdTomato 的分子尺寸较大，在融合蛋白实验中尤其需要验证标签是否影响目标蛋白的折叠、定位或生物学功能。

6. 转基因动物研究

tdTomato 也经常作为转基因动物模型中的荧光报告基因。通过特定启动子或条件性表达系统，可以让特定类型的细胞产生明显红色荧光，从而便于组织观察和细胞追踪。

tdTomato 与 Cre-loxP 系统有什么关系？

在许多转基因动物和细胞研究中，tdTomato 经常作为条件性荧光报告基因使用，并与 Cre-loxP 重组系统结合。

一个常见的设计思路是在 tdTomato 表达序列前设置由 loxP 位点包围的阻断序列。当细胞中存在具有活性的 Cre 重组酶时，Cre 可以介导相应 DNA 片段重组，使 tdTomato 得以表达。

因此，通过观察哪些细胞产生红色荧光，研究人员可以判断哪些细胞发生了特定的 Cre 介导重组。这类报告系统广泛用于细胞谱系追踪、基因功能研究和组织特异性遗传标记。

实验提示： 检测到 tdTomato 荧光通常代表报告系统发生了相应表达，但具体生物学含义取决于启动子、Cre 系统、报告载体以及实验模型的设计，不能脱离具体构建方式单独解释。

tdTomato 可以用抗体检测吗？

可以。虽然 tdTomato 本身能够产生荧光，但在部分实验中，直接荧光可能由于样本处理、组织固定、信号强度或成像条件而不足，此时可以使用能够识别 tdTomato 或相关红色荧光蛋白的抗体进行检测。

抗体检测可以根据实验目的应用于不同技术，例如：

• Western blot： 用于确认 tdTomato 或 tdTomato 融合蛋白的表达及表观分子量。
• 免疫荧光（IF）： 通过抗体放大 tdTomato 相关信号，并可与其他细胞标志物进行共染色。
• 免疫组织化学（IHC）： 在组织样本中检测 tdTomato 表达，可用于需要抗体显色或进一步组织学分析的实验。

选择抗体时，应确认产品是否明确支持目标实验应用和样本类型，并根据固定条件、抗原修复以及检测体系优化实验参数。

为什么有时看不到 tdTomato 荧光？

tdTomato 本身具有较强荧光，但实际实验中仍可能出现信号弱或检测不到信号的情况。这并不一定意味着 tdTomato 本身存在问题。

• 表达量不足： 启动子活性、转染效率或病毒感染效率较低都可能造成荧光信号较弱。
• 成像通道不合适： 激发光源和滤光片需要覆盖 tdTomato 的激发及发射光谱。
• 样本处理造成信号下降： 某些固定、包埋或组织处理步骤可能影响直接荧光信号。
• 组织自发荧光： 某些样本自身具有较强背景荧光，可能降低 tdTomato 信号与背景之间的对比度。
• 报告系统未被激活： 在条件性表达体系中，需要确认相应的启动子、重组酶或其他遗传调控系统是否正常工作。

使用 tdTomato 时需要注意什么？

虽然 tdTomato 是非常实用的荧光报告工具，但在实验设计过程中仍需要根据具体研究目的考虑其特点。

• 考虑蛋白大小： tdTomato 是串联二聚体结构，作为融合标签时需要评估较大的标签是否影响目标蛋白功能。
• 选择合适的成像通道： 根据 tdTomato 光谱以及显微镜配置选择适当的激发和发射滤光片。
• 注意光谱串色： 多色荧光实验中需要考虑 tdTomato 与其他荧光蛋白或荧光染料的光谱重叠。
• 设置阴性对照： 使用不表达 tdTomato 的细胞或组织帮助判断样本自发荧光和背景信号。
• 验证融合蛋白功能： 如果将 tdTomato 与目标蛋白融合，应确认融合后目标蛋白的定位和功能是否保持正常。
• 考虑直接荧光与抗体放大： 如果直接荧光不足，可根据实验目的评估是否使用抗体进行信号增强。

tdTomato 常见问题

tdTomato 是红色荧光蛋白吗？

是。tdTomato 属于红色荧光蛋白，其发射光谱位于橙红色至红色区域，因此通常作为红色荧光报告蛋白使用。

tdTomato 的激发波长和发射波长是多少？

tdTomato 的经典光谱参数中，激发峰约为 554 nm，发射峰约为 581 nm。实际成像时应根据显微镜光源、激光器及滤光片配置选择合适的检测条件。

tdTomato 是单体还是二聚体？

tdTomato 是一种串联二聚体荧光蛋白。名称中的“td”代表 Tandem Dimer，其结构由两个相关荧光蛋白单元串联组成。

tdTomato 和 mCherry 哪个更亮？

按经典荧光蛋白光物理参数计算，tdTomato 具有非常高的分子亮度，明显高于经典 mCherry。不过实际显微成像中的信号强弱还受到表达量、蛋白成熟、细胞环境和成像设备等多种因素影响，因此不能只根据理论亮度选择荧光蛋白。

tdTomato 可以和 GFP 一起使用吗？

在光谱和仪器配置合适的情况下，可以将 tdTomato 与 GFP 等绿色荧光蛋白用于多通道成像。实验设计时应使用合适的激发和检测通道，并评估两个荧光信号之间是否存在串色。

固定后还能看到 tdTomato 荧光吗？

tdTomato 在部分固定条件下仍能够保留一定的直接荧光，但具体效果取决于样本类型、固定剂、固定时间和后续组织处理流程。如果直接荧光不足，可以考虑使用针对 tdTomato 或相关红色荧光蛋白的抗体进行检测和信号放大。

为什么 tdTomato 经常用于细胞示踪？

tdTomato 具有较强的红色荧光信号，并且可以通过遗传方式在特定细胞中表达，因此适合标记和追踪细胞。结合组织特异性启动子或条件性遗传系统，还可以用于研究特定细胞群体及其后代。

总结

tdTomato 是生命科学研究中常用的高亮度红色荧光蛋白之一，经典激发峰约为 554 nm，发射峰约为 581 nm。其串联二聚体结构赋予其较强的整体荧光信号，使其成为报告基因和荧光成像研究中的重要工具。

tdTomato 可用于报告基因、细胞示踪、细胞谱系追踪、活细胞成像、转基因动物以及蛋白定位等多种实验。在选择 tdTomato 时，应综合考虑荧光亮度、蛋白大小、成像设备、光谱兼容性以及融合标签可能对目标蛋白产生的影响。

对于组织固定后直接荧光较弱或需要进一步信号放大的实验，也可以使用适用于相应实验方法的抗体检测 tdTomato 或相关红色荧光蛋白。

需要荧光蛋白抗体或实验技术支持？

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