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WB出现非特异时如何确定哪一个是目的带？封闭肽来帮您解决
免疫实验的非特异性结合
免疫实验中经常会遇到非特异性结果，引起非特异的原因有很多，其中主要原因之一是抗体有时会与抗原以外的蛋白质发生非特异性结合。这通常在存在多个抗原表位的多克隆抗体中更常见，但在单克隆抗体中也可能发生。发生这种情况时，弄清楚蛋白质的特异条带或染色非常重要。
例如在Western Blot实验中，可能会看到抗体与抗原以外的蛋白质发生非特异性结合，结果出现多于单一条带的结果，特别是存在多种亚型分子量的目的蛋白，弄清楚哪一个是靶标蛋白对结果下一步的分析非常重要。
为了确定哪个条带或染色是特异性的，当无法通过调整实验方法来改善，又找不到更合适的抗体时，可以进行免疫肽封闭实验。
在进行染色方案之前，将抗体中和（与对应于抗体识别的表位的过量肽一起孵育）。与封闭肽结合的抗体不再可用于与蛋白质印迹或细胞中蛋白质中存在的表位结合。然后将中和的抗体与单独的抗体并排使用，并比较结果。通过比较封闭抗体与单独抗体的染色，您可以看到哪种染色是特异性的：Western blot或用中和抗体进行的免疫染色将不存在这种染色。
什么是封闭肽
封闭肽是用于生产抗体的多肽（即免疫原多肽），特别是在生产多克隆抗体的情况下，常用目的蛋白的多肽片段作为免疫原。在进行免疫染色之前，可以通过将抗体与过量的肽（对应于抗体识别的表位）一起孵育来中和抗体，与封闭肽结合的抗体无法与WB膜上或IHC细胞中靶蛋白的表位结合，特异性目的条带或染色就无法显示。然后与原始抗体单独使用的结果进行比较，通过比较封闭抗体与原始抗体的染色，可以知道哪一个是特异性目的信号。免疫封闭肽实验也常用作抗体特异性质检的方法之一,如图1。
图1. PI3-kinase p85-alpha (Phospho-Tyr607) 抗体（货号orb106104）的大鼠肾组织WB检测，泳道1使用抗原封闭肽中和抗体（+），泳道2抗体单独孵育无封闭肽（-），可进一步验证泳道2中显示条带为目的蛋白
免疫实验中封闭肽的使用方法
材料和试剂：
1. 封闭缓冲液（WB使用5%脱脂奶粉/TBST或者3% BSA/TBST；IHC使用1% BSA/PBS）
2. 抗体
3. 封闭肽
4. 两个离心管
5. 两份实验样本（WB跑两个平行样本泳道，抗体封闭肽孵育时把膜按样本剪开；IHC准备两个同样的切片样本）
方法：
1. 确定在免疫实验中能获得稳定阳性结果的最佳抗体浓度，使用该浓度，确定免疫封闭肽实验所需的抗体量。
例如，确定抗体已成功以0.5 µg / ml浓度用于Western Blot实验，每次孵育需要2ml抗体溶液。因此封闭肽实验中每份样本需要准备1ug抗体。
2. 使用封闭缓冲液按所需量将抗体稀释，并将其平均分为至两个离心管。
3.其中一个离心管标上“ Blocked”，添加封闭肽至终浓度为1 µg / ml（本例使用2 µg肽，抗体：封闭肽比例为1：2）。在第二个离心管标上“ Control”，添加等量的缓冲液。
4.混匀后将两个离心管在室温下孵育30分钟，或在4°C下过夜。
5.在两个相同的样品上进行抗体孵育和染色方案，一个使用封闭抗体“ Blocked”，另一个使用“ Control”。注意把WB两个样本带剪开孵育，不要混淆条带！
6. 观察成像/染色情况。使用封闭抗体“ Blocked”时消失的信号（条带或者染色）是特异性的目的蛋白。如果通过抗原封闭肽竞争实验中，在WB中消失了多于1条以上的条带，则说明这些条带都包含抗原决定簇，可能是目的蛋白片段或包含目的蛋白的复合物。
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CD133 | |
Catalogue Code | Description |
Rabbit polyclonal antibody to CD133 | |
CD133 peptide | |
EGFP | |
Catalogue Code | Description |
Rabbit polyclonal antibody to EGFP | |
EGFP peptide | |
CD31 | |
Catalogue Code | Description |
Rabbit polyclonal antibody to CD31 | |
CD31 peptide | |
PGC1 alpha | |
Catalogue Code | Description |
PGC1 alpha antibody | |
PGC1 alpha peptide | |
CD163 | |
Catalogue Code | Category |
Rabbit polyclonal antibody to CD163 | |
CD163 peptide | |
Mlkl | |
Catalogue Code | Category |
Rabbit polyclonal antibody to MlKl | |
Mlkl peptide | |
CD8 | |
Catalogue Code | Category |
Rabbit polyclonal antibody to CD8 | |
CD8 peptide | |
Collagen X | |
Catalogue Code | Category |
Rabbit polyclonal antibody to Collagen X | |
Collagen X peptide | |