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ELISA从入门到精通，小白轻松养成大师的科研秘籍
ELISA（酶联免疫吸附试验，Enzyme-Linked Immunosorbent Assay），是一种基于“抗原-抗体”特异性结合原理开发的“高灵敏度”生物检测技术，通过酶标记系统实现“信号放大”和“可视化检测”。
该技术凭借其高特异性、灵敏度和操作便捷性，已成为医学诊断、基础研究、农业检测和环境监测等领域的重要工具。
ELISA的类型与适用场景
不同种类ELISA技术根据其原理和设计特点，适用于检测不同类型的生物分子。以下是四种主要ELISA类型的原理特点及典型应用场景：
一、直接ELISA
原理特点：
抗原直接包被在固相载体
使用酶标记的一抗直接检测
典型应用：
病原体检测：病毒颗粒（如流感病毒、HPV病毒）
纯化蛋白定量：重组蛋白浓度测定（如疫苗研发）
细菌表面抗原检测：如革兰氏阴性菌的脂多糖（LPS）
二、间接ELISA
原理特点：
酶标记二抗放大信号（信号强度提升5-10倍）
适用于多抗体检测场景
典型应用：
传染病诊断：HIV抗体筛查、新冠病毒IgG/IgM检测
自身免疫病检测：抗核抗体（ANA）检测
疫苗接种效果评估：麻疹/乙肝抗体滴度测定
三、夹心ELISA
原理特点：
双抗体夹心结构（捕获抗体+检测抗体）
灵敏度可达pg/mL级别
典型应用：
细胞因子检测：IL-6、TNF-α（炎症标志物）
肿瘤标志物：CEA（癌胚抗原）、PSA（前列腺特异性抗原）
激素检测：hCG（妊娠检测）、瘦素（代谢研究）
食品安全检测：牛奶中乳铁蛋白含量
四、竞争ELISA
原理特点：
样本抗原与标记抗原竞争结合有限抗体
信号强度与样本抗原浓度成反比
典型应用：
激素检测：皮质醇、睾酮（内分泌研究）
药物监测：血液中抗生素浓度（如青霉素）、治疗药物监测（如环孢素A）
环境污染物检测：农药残留（有机磷类）、重金属螯合物
过敏原检测：花生蛋白Ara h 1（食品过敏筛查）
通过匹配检测目标与ELISA类型，可显著提高检测灵敏度和特异性。例如：
夹心ELISA因双重抗体结合，可排除血清中其他蛋白干扰，适合复杂样本中的微量蛋白检测；
竞争ELISA通过竞争机制，能有效解决小分子难以被双抗体同时捕获的难题。
总的来说，可以根据以下检测目标特性，来确定Elisa类型:
检测目标特性 | 推荐ELISA类型 |
|---|---|
大分子抗原（>10 kDa） | 直接ELISA/夹心ELISA |
抗体滴度测定 | 间接ELISA |
低丰度蛋白（pg级） | 夹心ELISA |
小分子（<1 kDa） | 竞争ELISA |
ELISA的实验原理
下面让我们一起深入了解下2种常见的Elisa实验类型：
夹心法elisa实验:
竞争法ELISA原理解析：
ELISA的实验操作及解析
1.试剂盒兼容性
在选择你的试剂盒之前，需确保它与你的靶标和样品的相兼容性。
即理想情况下，您选择的试剂盒可以完全应用于您正在测试的样品（即血浆，血清，尿液，组织培养，唾液等）。其次检查试剂盒检测范围和试剂盒的灵敏度是否合适，保证该试剂盒能够检测到你正在验证的物种中的靶标。
2.在您开始测试之前对测定有完整的了解
每个试剂盒都是为了检测特定目标而研发的，并且具有特异性，但它不是“一刀切”。所以提前了解您ELISA试剂盒的灵敏度和特异性，以及如何精确地进行每个步骤，如何产生一个准确和可靠的标准曲线，显示您目标靶标的量化是很重要的。每个试剂盒都含有目标特异性试剂和缓冲液，您需要在开始实验前了解并理解每组参数，例如抗体类型，孵育时间，温度和报告系统。提前熟悉这些因素将节省您大量时间和避免失败重复的挫折感。
3.样本准备
在您实验前，请使用少量样本进行“预实验”摸索最适合稀释比例，您的样品必须与微量滴定板分析的规格兼容。被测试的生物标记的量将会有所变化，需要通过数据变化进行分析。参考试剂盒中的产品说明书，您的目标是寻找符合样本标准曲线的数据。请注意，含有干扰因素（如胆红素）的样品会产生不准确的结果。
4.抗体
如果您正在开发自己的ELISA测试，您选择的“抗体”将取决于您对特异性和亲和力的要求。 理论上单克隆抗体具有更高的特异性，更低背景，单克隆可以单独使用或与多克隆组合使用。 多克隆特异性较低，您每次都需要进行彻底的重新测试，以排除多重克隆批次间差异。 “匹配抗体对”是指单克隆抗体组合，多克隆抗体组合或两者的组合，用于检测单一抗原并且已被验证完全匹配，结合不同表位并作为良好的“捕获”和“检测”的抗体对。
5.样本最大化
为了充分利用您的试剂盒，Biorbyt建议您使用一系列稀释度的“对照样品”进行多次测试分析，以获得标准曲线。保存您最珍贵最有价值的样品，直到您确定最佳的稀释度。一旦你确定使用的样品和稀释度，你即可进行具体的实验设计。按照试剂盒的指导进行所有孔的操作，根据所提供具体信息可适当增加试剂用量。
6.重复性
最终，您的目标是获得准确性和可重复性，以创建可用且有价值的数据。为了实现一致性，优化性能和准确结果，请始终充分理解实验方案，并在您的实验中保持一致的操作体系。
实验中小tips：
在检测前，提前将试剂盒试剂放置室温（或按试剂盒说明书所建议的温度）约30分钟。冷冻样品在使用前也应该完全融化，避免样本多次反复冻融，冻融次数建议少于三次。
保证实验的环境条件，例如整个测定和测定之间的温度和湿度恒定。
确保所有设备都已校准，包括移液器，洗板机和读取器。
使用足量的抗体。
底物溶液应该是新鲜制备的，而不是在使用前数小时的储存溶液。
在整个测试过程中持续处理样品，并且每次都遵循相同的步骤。
在整个实验过程中，目视检查吸头和孔的吸出物、添加和取出的试剂应与方案数值一致，不应该因为操作不当出现偏差。
不要试图将不同种类的试剂盒混用以获得更多试剂。每种功能ELISA试剂盒都要准备好，在测定之间批次混合使用可能会对结果产生不利影响。
吸取试剂时，一旦试剂离瓶，不应该再放回原试剂瓶，防止交叉污染。
一旦测试开始，不要让孔干燥，保持板子密封以防止干燥。
7. 洗涤
实验中，“恰当的洗涤步骤”对于减少由于未结合的偶联抗体引起的背景信号是必要的，所以正确的洗涤步骤有助于增加分析的信噪比和保证单一特异性结合。
确保洗涤液体积足够多，以除去孔中游离的抗原或抗体的痕迹，从而减少不需要的背景信号。
保持孔底和洗涤端之间的建议距离，以减少残留的抗体/抗原液体，从而影响信号。
浮动头更灵活，更容易获得完整的清洗。
重复循环洗涤以确保除去不需要的抗原和抗体，但已结合的抗体会保留在结合原位。Biorbyt建议在每次孵育后进行三次洗涤。根据您所使用的板子是出厂包被还是您自己包被的，可以对洗涤方式进行调整，如果是您自己包被的板子，您可能需要增加清洗次数。
8. 缓冲液
使用试剂盒内提供的缓冲液和稀释液，或实验方案中建议的缓冲液和稀释液。缓冲区可以是单个或多个功能，它们在整个分析过程中用于包被，封闭，洗涤和稀释。包被是加入缓冲液以稳定抗原或抗体，然后孵育过夜以使稀释的抗原或抗体吸附到孔表面的过程。Biorbyt还提供多种类的通用ELISA缓冲液，可以节省时间和精力，加速实验过程而不影响效果。
9.封闭
封闭缓冲液有许多种类可供选择，有助于增加反应的稳定性，增强阻断性，减少交叉反应性和减少非特异性结合。含有不相关蛋白质的封闭缓冲液可用于防止检测抗体与板的非特异性结合。封闭缓冲液通常含有溶解于PBS中的BSA或牛奶酪蛋白。Biorbyt的阻断缓冲液系列将为您的分析提供完美的解决方案。
10.交叉污染
我们温馨提示，以干净和有序的方式工作是实验成功第一步。在开始分析之前，确定您需要使用的试剂量，准备适量的试剂并丢弃任何过量的试剂以防止交叉污染。通过更换每个样品、标准品或添加试剂之间的移液器吸头，避免样品或试剂的交叉污染。在液体清除和清洗过程中要格外小心。对于每次转移，请使用新的一次性试剂储存容器。
11.精确度
保证整个试验过程的准确性将提高您对数据的信心。您的目标是以高精确度生成多条标准曲线。您需要至少以一个样本两次重复（最好是三个重复）测试您的样本。您需要每个重复之间维持最小的可变系数（％CV），保证重复结果的稳定性。
如果数值明显异常，就需要分析可能导致结果异常的潜在原因。
异常数值产生的一个可能原因，是由于96孔板生产原因或由于外部孔引起的“边缘效应”。
会影响实验CV值的因素还包括：样品不正确的储存或制备方式，孔中有气泡，洗板不完全，试剂混合不当，不恰当的温度控制以及移液操作技术。光密度（OD）高于或低于标准曲线线性范围的样品将分别导致目标浓度被低估或被高估。
12.获得可靠的标准曲线
按照试剂盒制造商的建议，对试剂盒试剂进行恰当的保存，处理和移液操作至关重要。根据说明书和实验方案的推荐进行稀释剂，试剂和清洁剂的选择，并保持试剂盒使用的正确pH，温度和强度条件，检查小瓶/管试剂在（离心）旋转后充分溶解。每种测定方法不一定完全相同，但应该有可以接受的变化范围。应为每组样品制备标准曲线。在厂家建议的稀释范围内生成标准曲线，并确保您有足够的数据点。试图扩大延长标准曲线没有任何好处，因为抗体结合只能在一定范围内产生数据。如果您在结果中注意到“钩状效应”，可能的原因是分析物不足以与样品中抗原的量结合。这个问题也可以通过首先在一系列稀释度下进行预实验测试来解决。如果您发现结果灵敏度较低，则需要检查：
试剂盒保存是否正确
检测试剂是否充分发挥作用
您的样品类型和缓冲液是否兼容
靶蛋白和底物浓度/数量是否是足够的
读板器的吸附波长设置是否正确
记录时间是否足够长
您的ELISA试剂盒对您的测定是否具有正确的灵敏度。
13. 显色
经过您的精心准备，按照试剂盒中的指导设定孵育时间优化显色，以尽可能最清晰的方式显示您的结果。ELISA试剂盒中的底物通常是通过光度测定来分析颜色检测的。
如果您正在使用比色测定法，则所有颜色的变化必须避光进行。
如果你的蛋白质没有被检测到，你可以尝试通过减少稀释来增加它的浓度。
如果您检测到高背景信号，则需要分析以下可能导致背景的因素：如污染，洗涤效果不佳，洗涤时间不够，显色试剂过量，抗体浓度过高，使用错误的封闭缓冲液，非特异性抗体结合或其他未按照说明书的不恰当操作。
14.数据分析
为了最大限度地发挥您获得的数据的价值，需要充分地进行数据分析。我们建议使用专业的软件进行您的数据分析，按照建议的最佳波长进行读板，考虑扣除背景因素等。应根据试剂盒说明书或实验手册测定数据并绘制生成标准曲线。
Elisa实验中标准曲线的绘制，请参考往期文章
Biorbyt的团队可以为您从购买试剂盒到完成试验的整个过程中的任何阶段提供建议。 我们的产品、实验分析方案和系列检测设备均专门用于支持您的研究。
以ELISA间接法实验为例，操作视频如下：
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