免疫组织化学（Immunohistochemistry）

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免疫组化，是应用免疫学基本原理—抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究。

组织标本中分为石蜡切片（paraffin section）和冰冻切片（frozen section），按照标记物的种类可分为免疫荧光法、免疫酶法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自显影法等。以下是石蜡切片和冰冻切片和免疫组化的实验方案。

 

一．实验材料  
（一）实验标本    
     石蜡组织切片，冰冻组织切片

（二）实验试剂  
     二甲苯，无水乙醇，PBS，柠檬酸修复液，BSA，双氧水，HRP 标记二抗，DAB显色试剂盒，苏木素染色液，中性树胶，Triton-X 100，Tween-20

 

二．免疫组织化学（Immunohistochemistry）  
（一）免疫组织化学——石蜡切片（IHC-P）

1.    烘片：从4℃拿出石蜡切片，在60℃烘箱干燥30min，使组织贴片，高温处理便于下一步脱蜡；  
2.    脱蜡：100%二甲苯，100%二甲苯，100%乙醇，95%乙醇，80%乙醇，70%乙醇依次处理片子，二甲苯10min/次，乙醇5min/次；  
3.    复水：PBS处理20min；  
4.    抗原修复：柠檬酸修复液（PH6.0）修复，先将柠檬酸修复液加热到90℃左右，在92-98℃之间处理片子17min，后自然降温到室温后将片子取出，PBS洗涤，10min×3；  
5.    封闭：3% BSA-PBS 37℃处理1h，不用洗涤；  
6.    一抗孵育：用PBS稀释一抗（稀释比例视抗体而定），4℃过夜；  
7.    PBS洗涤，10min×4；  
8.    消除内源性氧化酶：3% H2O2室温处理13min，PBS洗涤5min×3；  
9.    二抗孵育：PBS稀释HRP标记二抗，1：500稀释，37℃孵育1h，PBS洗涤10min×3；  
10.    DAB显色：DAB显色试剂盒，按试剂盒操作指南配置显色液滴加到标本上，显色15-30min；  
11.    蒸馏水充分洗涤以终止显色反应；  
12.    核复染：苏木素进行核复染大概5-10min，浸自来水充分冲洗去多余的染色液，约10分钟，蒸馏水再洗涤一遍（数秒钟）；95%乙醇处理5秒；  
13.    脱水，透明：70%乙醇，80%乙醇，95%乙醇，100%乙醇依次脱水，2min/次；100%二甲苯，100%二甲苯透明，5min/次；  
14.    封片：中性树胶封片；  
15.    镜检。

 

（二）免疫组织化学——冰冻切片（IHC-F）

1.    烘片：从负80℃拿出冰冻切片，在60℃烘箱干燥30min，使组织贴片；  
2.    复水，打孔：0.5% Triton-X/PBS于37℃透化处理15-20min，PBS洗涤，5min×3；  
3.    抗原修复：柠檬酸修复液（PH6.0）修复，先将柠檬酸修复液加热到90℃左右，在92-98℃之间处理片子17min，后自然降温到室温后将片子取出，PBS洗涤，10min×3；  
4.    封闭：3% BSA-PBS 37℃处理1h，不用洗涤；  
5.    一抗孵育：用PBS稀释一抗（稀释比例视抗体而定），4℃过夜；  
6.    PBS洗涤，10min×4；  
7.    消除内源性氧化酶：3% H2O2室温处理13min，PBS洗涤5min×3；  
8.    二抗孵育：PBS稀释HRP标记二抗，1：500稀释，37℃孵育1h，PBS洗涤10min×3；  
9.    DAB显色：DAB显色试剂盒，按试剂盒操作指南配置显色液滴加到标本上，显色15-30min；  
10.    蒸馏水充分洗涤以终止显色反应；  
11.    核复染：苏木素进行核复染大概5-10min，浸自来水充分冲洗去多余的染色液，约10分钟，蒸馏水再洗涤一遍（数秒钟）；95%乙醇处理5秒；  
12.    脱水，透明：70%乙醇，80%乙醇，95%乙醇，100%乙醇依次脱水，2min/次；100%二甲苯，100%二甲苯透明，5min/次；  
13.    封片：中性树胶封片；  
14.    镜检。