免疫荧光（Immunofluorescence）

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免疫荧光染色技术是将荧光素作为抗体标记物进行免疫组织化学染色，带有荧光素的抗体孵育后可以直接使用荧光显微镜观测。该技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快；缺点是由于荧光素有一定的淬灭周期，玻片无法长期保存，需要在染色结束后尽快进行镜下观测分析。

免疫荧光染色分为直接法和间接法。直接法是荧光素直接标记在一抗上，孵育后直接观测，快速高效，还可以与多个标记抗体一起做多重荧光染色。间接法是荧光素标记在二抗上，相比直接法染色背景更干净，费用花费也少。

免疫荧光染色与免疫组化前期处理相同，因为内源性过氧化物酶对免疫荧光实验没有影响，同时双氧水反而会干扰到荧光素发光，所以这步操作在免疫荧光中不需要做。

以下是石蜡切片和冰冻切片免疫荧光间接法的实验操作方案。

 

一．实验材料  
（一）实验标本  
     石蜡组织切片，冰冻组织切片

（二）实验试剂 
     二甲苯，无水乙醇，PBS，柠檬酸修复液，BSA，荧光标记二抗, Triton-X 100，Tween-20，DAPI，防淬灭封片剂（IF专用）

 

二．免疫荧光（Immunofluorescence） 
（一）免疫荧光——石蜡切片（IF-P）

1.    烘片：从4℃拿出石蜡切片，在60℃烘箱干燥30min，使组织贴片，高温处理便于下一步脱蜡；  
2.    脱蜡：100%二甲苯，100%二甲苯，100%乙醇，95%乙醇，80%乙醇，70%乙醇依次处理片子，二甲苯10min/次，乙醇5min/次；  
3.    复水：PBS处理20min；  
4.    抗原修复：柠檬酸修复液（PH6.0）修复，先将柠檬酸修复液加热到90℃左右，在92-98℃之间处理片子17min，后自然降温到室温后将片子取出，PBS洗涤，10min×3；  
5.    封闭：3% BSA-PBS 37℃处理1h，不用洗涤；  
6.    一抗孵育：用PBS稀释一抗（稀释比例视抗体而定），4℃过夜；  
7.    PBS洗涤，10min×4；  
（以下步骤严格避光）  
8.    二抗孵育：PBS稀释荧光标记二抗，37℃孵育1h，PBS洗涤10min×3；  
9.    核染：DAPI进行核染10min，PBS洗涤10min×3；  
10.    脱水，透明：70%乙醇，80%乙醇，95%乙醇，100%乙醇依次脱水，2min/次；100%二甲苯，100%二甲苯透明，5min/次；  
11.    封片：防淬灭封片剂封片；  
12.    镜检。

 

（二）免疫荧光——冰冻切片（IF-F）

1.    烘片：从4℃拿出石蜡切片，在60℃烘箱干燥30min，使组织贴片，高温处理便于下一步脱蜡；  
2.    复水，打孔：0.5% Triton-X/PBS于37℃透化处理15-20min，PBS洗涤，5min×3；  
3.    抗原修复：柠檬酸修复液（PH6.0）修复，先将柠檬酸修复液加热到90℃左右，在92-98℃之间处理片子17min，后自然降温到室温后将片子取出，PBS洗涤，10min×3；  
4.    封闭：3% BSA-PBS 37℃处理1h，不用洗涤；  
5.    一抗孵育：用PBS稀释一抗（稀释比例视抗体而定），4℃过夜；  
6.    PBS洗涤，10min×4；  
（以下步骤严格避光）  
7.    二抗孵育：PBS稀释荧光标记二抗，37℃孵育1h，PBS洗涤10min×3；  
8.    核染：DAPI进行核染10min，PBS洗涤10min×3；  
9.    脱水，透明：70%乙醇，80%乙醇，95%乙醇，100%乙醇依次脱水，2min/次；100%二甲苯，100%二甲苯透明，5min/次；  
10.    封片：防淬灭封片剂封片；  
11.    镜检。