【biorbyt 技术】蛋白质磷酸化如何检测？

 

蛋白质磷酸化是生物界最普遍，也是最重要的一种蛋白质翻译后修饰，20世纪50年代以来一直被生物学家看作是一种动态的生物调节过程。在细胞中，大概有三分之一的蛋白质被认为是通过磷酸化修饰的。   

蛋白质的磷酸化修饰与多种生物学过程密切相关，如DNA损伤修复、转录调节、信号传导、细胞凋亡的调节等。近年来随着蛋白质组技术的不断发展，蛋白质磷酸化的研究越来越受到广泛的关注。

 

磷酸化的过程   

磷酸化是一种重要的蛋白质翻译后修饰方式，一般通过蛋白激酶和蛋白磷酸酶对底物蛋白的特定氨基酸进行调控，在原核和真核生物的生命活动中都发挥关键作用。   

 

磷酸化的过程是由蛋白质激酶（Kinase）催化的把ATP或GTP的γ位磷酸基转移到底物蛋白质的氨基酸残基，如丝氨酸（Serine，Ser，S）、苏氨酸（Threonine，Thr，T）和酪氨酸（Tyrosine，Tyr，Y）等上的过程，而其逆向过程则是由蛋白质磷酸酶去除相应的磷酸基团。正是这两种酶的相反作用及其中所涉及到的能量消耗与生成使磷酸化成为体内很多生理活动调控的首选方式。   

 

蛋白质磷酸化的类型   

根据被磷酸化的氨基酸残基不同，可将磷酸化蛋白质分为4类，即O-磷酸盐蛋白质、N-磷酸盐蛋白质、酰基磷酸盐蛋白质和S-磷酸盐蛋白质。   

 

O-磷酸化在酸性条件下非常稳定，因此在细胞生物学和磷酸化蛋白质组学中研究广泛。N-磷酸化的不稳定性导致其检测极具挑战性，而且由于缺少催化N-磷酸化的蛋白激酶和蛋白磷酸酶，从而进一步限制了其研究。至于另外两类磷酸化（S-磷酸化和酰基磷酸化）的研究报道更是非常少。   

不同的物种发生磷酸化的氨基酸残基会存在不同，在真核生物中，磷酸化主要发生于丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸等残基上；而在细菌中，蛋白质主要通过天冬氨酸、谷氨酸和组氨酸等残基被磷酸化；有些蛋白质在原核生物和真核生物中均可被磷酸化，它们的磷酸化位点通常是精氨酸、赖氨酸和半胱氨酸残基。   

 

蛋白质磷酸化检测方法   

蛋白质磷酸化最常见的检测方法有Western blot蛋白免疫印迹、32P 同位素放射性标记法和质谱分析法3种。 

 

32P 同位素放射性标记法 

以放射性同位素32P标记（γ-位的磷）的ATP为磷酸基团供体，在激酶催化下，将带有32P标记的磷酸基团转移到底物蛋白上。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯凝胶（SDS-PAGE）电泳分离反应混合物中的蛋白。用X-光片放射自显影或用磷储屏检测磷酸化蛋白。该方法是最直接的蛋白体外磷酸化检测方法，具有灵敏度高、测试结果准确等优点，在蛋白质磷酸化分析实验中广泛使用。   

 

质谱分析法   

运用质谱可以测定蛋白质的一级结构，包括分子量、肽链氨基酸排序以及多肽或二硫键数目及其位置，是一种可发现和鉴别翻译后修饰的方法。蛋白磷酸化理论上都可以运用质谱检测，但质谱分析酶解磷酸化蛋白并不能检测全部蛋白序列，可能会有重要磷酸化区域被忽略，且细胞中磷酸化蛋白含量甚微，磷酸化肽段的信号容易被非磷酸化肽段的信号所抑制，所以有必要在质谱分析之前进行磷酸化蛋白和肽段的富集。   

 

Western blot蛋白免疫印迹 

蛋白质磷酸化作用可以通过Western blot (WB)利用抗磷酸化蛋白的抗体进行检测。WB特异性好、分辨率高，采用SDS-PAGE电泳，一抗与二抗结合并以自显影或者底物显色来显示蛋白条带。使用WB检测磷酸化的蛋白质时，选择合适磷酸化检测抗体和实验过程中防止蛋白质去磷酸化是关键。特别是针对细胞中比较弱的磷酸化信号，需要经过磷酸化富集后Western blot才能检测到。 

关于使用WB检测磷酸化蛋白的实验操作，可以点击以下文章查看更多注意事项：[技能get✅]磷酸化蛋白Western Blot的注意事项 

 

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参考资料：

1. Aebersold R, Goodlett D R. Mass spectrometry in proteomics[J]. Chemical reviews, 2001, 101(2): 269-296. 

2. Deng X Y, Jiang Y, He F C. Technique progress in the study of protein/peptide phosphorylation[J]. Yi Chuan= Hereditas, 2007, 29(10): 1163-1166. 

3. Huang Z Y, Yu Y L, Fang C Y, et al. Progress in identification of protein phosphorylation by mass spectrometry[J]. J Chin Mass Spectrom Soc, 2003, 24(4): 494-500.