【Biorbyt 技术】标记抗体到底好在哪？

 

什么是标记抗体？

标记抗体一般是指将荧光素或荧光团，生物素或者酶（HRP, AP）等标记物通过共价键或其他方式连接到一抗或二抗的特定部位上后所得到的直标抗体。

➤ 荧光素标记

荧光色素是最常用于标记抗体的标记物之一。荧光素经恰当的激发可发光，从而得知抗体的定位和待测抗原的分布情况，主要用于细胞分选或高分辨率免疫染色，是一种非常好的亚细胞水平精确定位的方法。

➤ 酶标记

酶标记抗体是将酶（HRP，AP等）与特异性抗体经适当方法连接而成，其应用范围非常广泛，结果即时可见、敏感性高，但较难应用于定量分析。

➤ 生物素标记

生物素（Biotin）标记反应简单、温和且很少抑制抗体活性，将生物素与抗体共价结合是一种非常简便、直接的标记方法。生物素与亲和素的反应体系可以扩大信号反应级别，有助于表达量低的蛋白检测。

 

标记抗体的优势

增强放大效应：标记物如酶、荧光素等具有高度的敏感性。荧光素或酶等标记物的分子量相对IgG来说较小，如一个IgG分子上可以标记15-20个FITC分子，一个IgG分子也可以标记多个HRP分子，通过这些标记物的增强放大效应，可以更直观地观察到抗原与抗体的反应情况，从而更准确地判断结果。

提高检测灵敏度：通过标记技术，如酶标记法、荧光素标记法、生物素标记法等，抗体与标记物的结合能够形成多元复合物，这种复合物的形成不仅增强了检测的灵敏度，还提高了识别的特异性。这使得标记抗体在检测过程中能够更准确地识别和结合特定的抗原，从而提高检测的准确性。        

定位分析：标记抗体主要用于抗原的定位分析，特别是在细胞、亚细胞、超微结构及分子水平上对抗原、抗体反应进行深入的定性和定位研究。例如，荧光素标记的抗体可以用于高分辨率免疫染色，实现亚细胞水平的精确定位。        

定量检测：在某些情况下，标记抗体也可以对混杂有大量其他分子的样本中的抗原进行定量检测。例如ELISA试剂盒的开发中就用到了生物素标记的一抗，最终实现了ELISA试剂盒的定量检测。        

方便应用：例如荧光标记的一抗，在免疫荧光或流式细胞术实验时，在孵育完荧光一抗后，就可以直接显微镜观察，无需再加入二抗。

 

标记抗体的应用

1）免疫荧光染色：荧光一抗可用于组织或细胞的荧光染色。荧光一抗在免疫荧光实验中不仅省去了加二抗的过程，使实验更便捷。也更多用于多色免疫荧光共染中，因为商业化的一抗大多为兔抗或者鼠抗，当要进行多个靶标的多色荧光共染时，往往面临二抗选择问题，这时就可以选择不同颜色的荧光一抗。

2）流式细胞术：荧光抗体技术结合流式细胞仪，可用于细胞表型和功能的快速分析，为生物医学研究和临床应用提供重要支持。        

3）ELISA：ELISA试剂盒的开发主要分为夹心法和竞争法，在试剂盒的开发中也会用到标记一抗，主要是生物素标记的一抗，一般一个IgG分子量可以结合3-5个生物素分子，然后通过生物素 与 亲和素的特异性结合从而起到放大效应。另外，利用FITC与anti-FITC结合放大效应，FITC标记的一抗也可用于试剂盒的开发中。 

4）其他应用：如酶标二抗和荧光二抗。在WB，IHC，ELISA等实验中，一般都要用到酶标二抗，而在免疫荧光或流式细胞术中，则需要用到荧光二抗。

 

常用荧光标记物

FITC：异硫氰酸荧光素（Fluorescein Isothiocyanate），是一种对pH和 Cu2+敏感的荧光染料。可用作胺标记的荧光探针，CAS 3326-32-7。分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。（biorbyt也可提供FITC染料，货号：orb1308303）。

Alexa Fluor 488：Alexa Fluor 488是一种明亮的绿色荧光染料，其激发设计用于488 nm激光线。Alexa Fluor 488染料在很宽的摩尔范围内对pH不敏感。是免疫荧光和流式细胞术常用的荧光标记物。  

CY3：Sulfo-Cyanine3 是传统的蛋白质和核酸的橙色荧光标记物(λex=554, λem=568)。CAS 146368-13-0。具有高光稳定性、高抗光漂白性、荧光亮度高、溶于水和有机溶剂以及兼容性好等优点（biorbyt也可提供CY3货号       orb1307215）。

PE：藻红蛋白(P-phycoerythrin,PE)是从红藻中分离纯化的，能发出强烈的荧光，具有很好的吸光性能和很高的量子产率，在可见光谱区有很宽的激发及发射范围。是一种有效的荧光探针含有四个携带发色团的亚基，显示出极其明亮的红橙色荧光。(λex=496 nm，λem=578 nm)。

CY5：Sulfo-Cyanine5，CY为花菁 (Cyanine) 的缩写，是由奇数个甲基单位连接的两个氮原子组成的化合物。菁类化合物具有波长长、吸收和发射可调、消光系数高、水溶性好、合成相对简单等特点。是一种明亮的红色荧光染料。由于它的激发和发射峰都在长波长红光区，而在这个区域生物样品的自身荧光较弱，因此，相对于Cy3，Cy5具有明显的灵敏度优势。另外，它的荧光（ex：667nm）处在大多数仪器的检测范围内，所以它也是非常常见的荧光标记化合物。（biorbyt也可提供CY5，货号 orb1707415）。 

PE-CY5：是一种复合荧光染料/串联染料，属于藻红蛋白偶联物，具有吸光性好和光量子产率高的特点，在此类复合染料中，激发能量可从PE传递到Cy5上， 其中PE与Cy5偶联。当被488纳米光激发时，被激发的荧光染料（PE）能够将其荧光能量转移到花菁分子上，然后花菁分子在670纳米处发出更长波长的红色荧光。

APC：别藻蓝蛋白（Allophycocyanin）是一种从红藻中分离出的强烈明亮的藻胆蛋白，具有高量子产率的远红色荧光。它被594和633 nm的激光线激发，在650 nm处具有最大吸光度，在660 nm处具有荧光发射峰。

 

直标一抗如何选择？

免疫荧光时，通常需要同时检测组织或细胞样本中的多个靶标，常常会利用直标一抗进行免疫荧光共染色，这时一般尽量选择光谱重叠比较少的荧光基团进行组合。例如，可选择一个FITC的直标一抗和 一个AF647的直标一抗进行两个不同蛋白的共染色。

关于免疫检测实验中如何选择荧光标记物，点击以下视频了解。

 

      
 

根据目标蛋白的表达丰度，选择匹配的荧光标记物，来保证合适的荧光强度。不同荧光标记在不同的仪器上可能强度不同，在某些仪器中：PE>APC>PE-Cy5> FITC。通常来说，PE最强，适用于弱表达抗原。FITC强度较弱，适用于强表达抗原。在流式细胞术时，因为每个抗体只能检测一种荧光，各个通道间的荧光可以随意搭配，例如要同时检测三个靶标，则可在红，绿，黄中各选一个适当的荧光一抗，如PE-CY5, FITC，PE。切忌所有指标选择同一个通道的荧光标记，以防止荧光的重叠和相互干扰。

 

关于流式细胞技术中如何选择荧光标记物，可以点击以下文章链接获取更多详情：【Biorbyt 技术】如何选择合适的流式抗体？

 

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