【Biorbyt 抗体验证】敲除验证和封闭肽验证

 

抗体验证（Antibody Validation）即特定抗体适用于某预期应用的实验证据及数据报告。表征良好的抗体具有较好的一致并能生成可靠的实验数据，对于解决“实验可重现性危机”至关重要。鉴于这一现象，学术界积极采取了许多措施以提高抗体验证品质，包括敲除（KO）验证，封闭肽验证。

这一期，biorbyt 来和大家聊聊这两种抗体验证方法的优缺点。

 

 

封闭肽验证

封闭肽封闭实验是一种用于验证抗体特异性的重要实验方法，尤其在免疫印迹（如Western Blot）和免疫组织化学（IHC）等实验中具有重要意义。封闭肽是与抗体特异性结合的多肽片段，包含抗体识别的表位。在封闭肽封闭实验中，封闭肽会与抗体结合，从而阻断抗体与靶蛋白上相应表位的结合。通过比较封闭抗体与单独抗体的染色结果，可以判断哪种染色是特异性的。

 

封闭肽实验详细介绍请查看我们往期文章：WB出现非特异时如何确定哪一个是目的带？封闭肽来帮您解决 

 

➤ 封闭肽实验注意事项

1.并非某个靶标的任一一段封闭肽就能用来封闭该靶标的所有抗体，所选封闭肽应与抗体特异性结合，最好选择对应抗体免疫原作为封闭肽。购买封闭肽前最好咨询厂家是否适用用于测试抗体。

2.封闭肽的浓度需要足够高以完全阻断抗体与靶蛋白的结合，但过高的浓度可能会导致非特异性结合。因此，需要根据实验情况调整封闭肽的浓度。且一般建议等体积的抗体和多肽混合。

3.封闭肽与抗体的孵育时间需要足够长以确保充分结合，但过长的孵育时间可能会导致抗体失活。因此，需要根据实验情况确定合适的孵育时间。一般建议室温2h或4℃过夜。

 

 

敲除验证

在用于验证抗体的所有方法中，敲除（KO）验证的可接受性和可信度都很高(Madhusoodanan, 2014; Rhodes & Trimmers, 2008)。KO验证是一种被广泛认可的抗体特异性验证方法，它通过利用基因敲除技术生成的细胞系或样本来评估抗体的特异性。 

 

➤ KO验证的基本原理

KO验证基于KO样品或细胞系的使用，这些样品或细胞系由于负责编码靶蛋白的基因被敲除或消除，因此不表达目的蛋白。在KO细胞系中测试特异性抗体时，如果抗体具有高度的特异性，那么它不会产生信号，因为不存在靶蛋白。相反，在野生型（wild type, WT）细胞系中测试时，特异性抗体会产生特异性靶蛋白信号。通过这种方式，KO验证作为真正的阴性对照，以确认抗体对目的蛋白的特异性。

 

➤ KO验证的步骤

1. 基因敲除细胞系的制备：

• 利用CRISPR-Cas9等基因组编辑技术敲除细胞系中编码靶蛋白的基因。

• 通过Sanger测序等方法验证基因敲除的成功和特异性。

 

2. 抗体测试：

• 在KO细胞系和WT细胞系中分别加入待测抗体。

• 通过Western blot检测条带。

 

3. 结果分析：

• 如果在KO细胞系中未检测到预期条带，而在WT细胞系中检测到特异性条带，则表明抗体对靶蛋白具有特异性。

• 如果在KO细胞系中也检测到对应条带，则可能表明抗体存在非特异性结合，需要进一步验证或考虑更换抗体

 

➤ KO验证抗体的优势

1. 高特异性：KO验证通过消除靶蛋白的存在来评估抗体的特异性，因此结果更为可靠。

 

2. 节省时间和资源：通过提前验证抗体的特异性，可以避免在后续实验中因抗体非特异性而导致的资源浪费和时间延误。

 

3. 提高实验结果的可重复性：使用经过KO验证的抗体可以显著提高实验结果的可重复性，从而增强研究的可信度。

Biorbyt 现在已使用KO验证作为标准进行验证，力争将KO验证作为严格抗体验证过程的标准应用于每种抗体产品。

如biorbyt orb11559 Vimentin antibody，KO验证结果如下：

Sample: Hela(Human) Cell Lysate at 30ug,Hela KO Vimentin (Human) Cell Lysate at 30 ug. Primary: Anti- Vimentin (orb11559) at 1/1000 dilution Predicted band size: 53 kD Observed band size: 53 kD

Vimentin理论分子量是53kDa，和野生型Hela相比，KO Vimentin的Hela样本在53kDa处无条带，说明野生型Hela样本53kDa处的为特异性的Vimentin条带，该抗体对Vimentin特异性结合。

 

Biorbyt 可提供多种热门靶标的KO验证抗体，部分热销货号如下： 
 

Catalog No.	Product Name	Tested applications
orb11559	Vimentin(KO  Validated) antibody	WB ELISA IHC-P IHC-F Flow-Cyt ICC IF
orb500627	GSK-3 Beta (KO  Validated)antibody	WB ELISA IHC-P IHC-F IF
orb559204	HDAC2 (KO  Validated)antibody	WB IHC-P IHC-F  Flow-Cyt ICC IF
orb500963	NFkB p65 (KO  Validated)antibody	WB ELISA IHC-P IHC-F  IF
orb1974725	Phospho-EIF2S1  (Ser51)  (KO Validated)antibody	WB IHC-P ICC IF
orb500815	CK18 (KO  Validated)antibody	WB ELISA IHC-P IHC-F  Flow-Cyt ICC IF
orb500764	STAT3 (KO  Validated)antibody	WB IHC-P IHC-F ICC IF
orb10334	ICAM1 (KO  Validated)antibody	WB ELISA IHC-P IHC-F  Flow-Cyt ICC IF
orb704275	Beclin 1 (KO  Validated)antibody	WB ELISA IHC-P  Flow-Cyt
orb11372	SIRT1 (KO  Validated)antibody	WB ELISA IHC-P IHC-F  Flow-Cyt IF
orb4670	Bad (phospho-Ser118)  (KO Validated)antibody	WB ELISA IHC-P IHC-F  Flow-Cyt IF
orb158626	TMP21 (KO  Validated)antibody	WB ELISA IHC-P IHC-F  ICC IF
orb704256	PARP (KO  Validated)antibody	WB IHC-P ICC
orb704388	HDAC1 (KO  Validated)antibody	WB IP IHC-P IHC-F ICC  IF
orb500620	HSP90 Beta (KO  Validated)antibody	WB
orb560168	STAT3 (KO  Validated)antibody	WB IHC-P IHC-F ICC IF
orb704394	SQSTM1 (KO  Validated)antibody	WB IHC-P
orb704385	Lamin B1 (KO  Validated)antibody	WB IHC-P IHC-F IF
orb500972	Galectin 3 (KO  Validated)antibody	WB ELISA Flow-Cyt ICC
orb704255	PTPN1 (KO  Validated)antibody	WB IHC-P ICC
orb704252	SCD (KO  Validated)antibody	WB IHC-P IHC-F ICC IF
orb704395	SMARCA4 (KO  Validated)antibody	WB IHC-P ICC
orb704392	SUZ12 (KO  Validated)antibody	WB ELISA IHC-P ICC
orb13623	NRSF/REST (KO  Validated)antibody	WB ELISA IP IHC-P  IHC-F IF
orb157592	HSP90 alpha (KO  Validated) antibody	WB ELISA IHC-P IHC-F  ICC IF
orb704257	PDCD4 (KO  Validated)antibody	WB IHC-P
orb157966	Neurotensin Receptor  1 (KO Validated) antibody	WB ELISA IHC-P IHC-F  IF
orb500624	EGFR (KO  Validated)antibody	WB IHC-P IHC-F IF
orb704260	P21 (KO  Validated)antibody	WB IHC-P IHC-F
orb704253	RHOC (KO  Validated)antibody	WB IHC-P IHC-F IF
orb704391	TAGLN2 (KO  Validated)antibody	WB ICC IF