【Biorbyt 技术】免疫组化/荧光如何选择固定剂？

 

 

IHC & IF/ICC 样本固定 
 

       免疫组化/荧光实验中使用的所有样品，新鲜取材后都必须及时固定以防止离体太久而发生组织自溶长菌，抗原扩散或丢失，并保持组织（细胞）形态以便于后续检测观察。

 

       固定会改变组织的化学成分，通常需要在保留组织结构和保留抗原表位之间进行折中，选择最适合自己实验需求的固定试剂。细胞或组织的不完全固定（或未固定）可能会导致组织内的靶蛋白快速降解，同时会降低特异性免疫反应性。相反，过度固定可能会导致抗原表位被掩盖或导致强烈的非特异性背景染色，从而影响靶蛋白的标记和观察。

 

       所以在免疫组化/荧光的样品制备方面必须考虑固定剂的选择和固定的方法。此外，固定时间、温度和pH值都会影响固定效果。以下小编将列举最常用的几种固定剂，供您实验参考。

 

 

甲醛

 

       甲醛是最常用的固定剂，可以有效地保留组织和细胞内的蛋白质靶标。甲醛介导的组织固定依赖于甲醛的亚甲基 (-CH2-) 将蛋白与蛋白或者蛋白与核酸形成交联。甲醛作为亚甲基 (-CH2-) 的提供者，可以与NH2（氨基）和 CONH（肽）、OH（羟基）、SH（巯基）基团中的两个基团发生化学反应，使自由的分子链被甲醛交联起来，失去原有的生理功能。

 

       甲醛是大多数免疫组化/荧光应用的不错选择，甲醛固定的组织形态结构保存好，穿透性强，组织收缩少，但不是绝对的通用型固定剂。甲醛过度固定会导致作为表位的一部分氨基酸发生修饰，阻止抗体与其结合。所以在大多数情况下，需要使用抗原修复技术重新暴露抗原表位以恢复其抗体结合能力。有研究表明甲醛可诱导磷酸化依赖性表位从膜到细胞质的细胞内易位。在这种情况下，冰的无水甲醇或无水乙醇是合适的替代固定剂。

 

       虽然有许多不同的固定剂可用，但甲醛仍是最常用的，并且是大多数免疫组化样本固定剂的首要选择。甲醛溶液应分装并冷冻，或在 4-8°C下储存不超过1个月。

 

 

醇类

 

       用于细胞和组织固定的最常用的醇类固定剂是甲醇和乙醇。甲醇和乙醇的分子结构与水非常相似，因此，它们可以与水竞争蛋白质氢键，取代组织中的水分子以起到固定作用。但这会导致蛋白质通过降低其介电常数而在其等电点沉淀，并且可以由于构象变化而阻断抗体与表位的结合。虽然醇通过破坏疏水键影响蛋白质的三级结构，但它们似乎可以稳定蛋白质的二级结构。

 

       然而，通常认为醇类不能像基于甲醛固定剂那样保持较好的组织形态。醇类的渗透性不如甲醛好，主要用于固定冷冻组织切片和细胞。因此，醇类固定剂更适合膜表面抗原。醇类固定可以避免甲醛固定的蛋白交联发生，所以不建议在醇类固定后再进行抗原修复，因为没有必要，并且可能会损害组织切片或细胞的完整性。

 

 

丙酮

 

       丙酮是一种强脱水剂，可导致组织蛋白不可逆沉淀，抗原保存性好，脱色性更强，常用于未固定的速冻组织切片，然后用酒精或甲醛固定，也常用于部分细胞爬片固定。

 

 

组织固定

 

       在研究小鼠、大鼠和豚鼠等小动物的完整组织时，整个动物灌注固定通常是保存抗原的最佳方法。动物灌注就是用固定液动态灌注以替换动物的全身血液，以达到初步固定的作用，同时也可以防止血液红细胞残留引起切片观察假阳性。然而，整个动物灌注可能不足以固定需要研究的目标组织。在这种情况下，还需要将灌注后的动物解剖下来的组织再次浸入固定液中进行固定。例如，4% （多聚）甲醛的PBS溶液是组织灌注和浸泡固定的常用溶液。

 

       为了在浸泡固定过程中增强固定剂的渗透，建议组织厚度不超过10毫米。为了完全固定，固定液的体积应比组织的体积大50-100倍。通常在室温下固定2-24 小时，固定时间醛类建议24小时以内，醇类，丙酮2小时以内，组织大小厚度略有差异。根据具体样本特殊性优化固定条件非常重要，因为固定不足或过度固定可能会降低或消除组织免疫反应性。